QPCR实验报告

一、实验材料：

（一）样品-组织样本

（二）试剂与仪器：

MaximaTMSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2X)( K0221，Thermo ) ；总RNA提取试剂盒（LS1040，上海Promega公司）；miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)（MR101-02，Vazyme）；通用反转录试剂盒(K1622， Thermo公司)；Marker1 (M1081，东盛生物公司)；无水乙醇（广州化学试剂厂）

FastPrep-24匀浆机（MP公司）；Ultra Pure UF纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；JS-680A自动凝胶图像分析仪（上海培清科技有限公司）和Step One QPCR仪（Applied Biosystems）                                             

二、实验步骤：

1.      准备 1.5 mL 的 EP管；

2.      冰上操作：在 EP管中加入相同量的约0. 5µg模板 RNA，1µL Oligo(dT)18引物， DEPC水定容至12µL，短暂离心；

3.      65℃水浴5分钟后，冰上冷冻；

4.      短暂离心后，冰上操作：加入 4µL 5×reaction Buffer，1µL RibolockTM Ribonuclease Inhibitor，2µL(10mmol)dNTP mix，1µL (200U/µL)ReverAid M-MuLV反转录酶（总反应体积20µL）；

5.      短暂离心，42℃水浴60分钟进行反转录；

6.      70℃水浴5分钟灭活逆转录酶，终止反应，再冰上冷冻；

-20℃保存，或立即进行PCR。

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