原味杂交实验报告

一、 实验对象-组织标本

二、实验器材及试剂

1、 实验器材

2、 主要实验试剂

三、原位杂交实验步骤

1.烤片

2.脱蜡

在通风橱中进行以下操作:

A.将各200毫升二甲苯分别倒入两洗液缸中。

B.将带有玻片的玻片架放入，不时上下晃动来回洗涤，共5分钟。

C.立刻移入另一盛有200毫升新的二甲苯的洗液缸，再不时上下晃动来回洗涤5分钟。

D.马上用200毫升100%乙醇进行1分钟洗涤，重复两次。

E.用手尽量甩干玻片面上的酒精，将玻片放在晾片板或纸巾上，正面朝上，完全风干。

3. 组织预处理

请用加热器开始加热盛有500毫升1X预处理液Bplus的烧杯(请在高温加热器上直接加热,勿用水浴蒸煮)(参见视频).

A.将玻片放在注水后的湿盒中，依组织面积大小滴加6-8滴(300-400ul)预处理液A完全覆盖组织,盖上盖子室温放置10-30分钟(通常10分钟)(参见视频)。

B. 手持玻片甩掉玻片上的液体，用200ml超纯水在洗缸中震荡洗涤约30-60秒。换水共洗涤三次。

C. 确认预处理液1XBplus已经加热至温度为95-100℃。需使用温度计插入液面下准确测量，肉眼可见沸腾持续有大泡冒起即可，请勿沸腾太久(超过10分钟)以免液体蒸发太多(参见视频)。

D. 将载有玻片的玻片架浸入沸腾的预处理液1XBplus中，煮的时间请按照附录建议的方法来确定最佳时间(通常为15分钟)。

E.立即取出玻片架浸入含有200毫升的超纯水的洗液缸中上下搅动清洗1分钟，换新水重复步骤共三次洗涤。

F.将玻片移入装有200ml100%乙醇的洗缸中上下晃动十次，然后静置3分钟。将玻片从乙醇中取出，手持尽量甩去玻片上的乙醇，面朝上放置在室温下待玻片自然风干。

4.画疏水圈

请只使用我们建议的疏水笔类型,其它免疫组化疏水笔会导致杂交过程中疏水圈脱落。

A.将疏水笔笔尖在吸水纸上轻触几下，让疏水液流畅地缓慢渗出。

B. 在组织周围画一圈蓝色的疏水圈,风干5-20分钟左右至完全干透(疏水圈内面积最小不能小于15mmX15mm).

5. 消化酶消化

请务必在恒温箱中预热1X消化酶II工作液至40℃(每片约需200-400ul,视切片面积而定)

A.将原位杂交仪设置为实际杂交温度40℃，并确认盖子内面插入两条已水饱和的保湿条!(参见视频)从此步骤开始保持杂交仪始终处于40℃杂交状态。

B.将所有玻片摆放在原位杂交仪的杂交面板上。依次加200-400ul消化液，必须完全覆盖组织(某些类型玻片或组织因表面张力不易完全覆盖，可用移液器的移液头协助,或参照视频指导有技巧地使用滴液头在滴液的同时使液滴覆盖住组织)。盖上盖子，并开始计时。最优的消化时间请按照附录里的办法来确定。(通常为15分钟)

C.在洗缸中注入200ml超纯水并放入一玻片架。消化结束后，将玻片依次取出，甩掉消化液，放入玻片架中，在200ml超纯水中上下洗涤1分钟。

D.重复步骤C两次共三次洗涤。

*孵育结束时请按顺序依次按时取出玻片，保证每一张玻片的消化时间都为最优时间。

*从此步骤开始绝不可以让玻片干燥，应及时滴加反应液保持湿润

6.探针杂交

所有阳性，阴性/空白探针使用前需在40℃恒温箱中预热至少6分钟左右，并上下颠倒混匀至肉眼观察无沉淀

A.(参见视频)逐一将玻片取出，尽量甩掉正面残存的水，背面用吸水纸擦干，將玻片放在孵育板上快速在疏水圈范围内滴入8-12滴(约200-300ul)预热的探针杂交液覆盖整片组织。(尽快操作请勿让组织干燥)。然后处理下一张玻片。

B.盖上孵育器盖子，在40℃杂交2小时。

7.洗涤玻片

A.将空玻片架放入盛有200ml 1x洗液的洗片缸中。

B.逐一将玻片从孵育器取出，甩掉探针杂交液，将玻片放入玻片架。

C.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm).

D.换新的1x洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

8.反应1

请确认反应1已在40℃恒温箱中预热至少6分钟左右，并上下颠倒混匀至肉眼观察无沉淀

A.逐一将玻片取出，甩掉正面残存的洗液，背面用吸水纸擦干，将玻片放在孵育器面板上后立即在疏水圈范围内滴入6-8滴(约150-200ul)预热的反应液1覆盖整片组织。然后接着处理下一张玻片直至全部滴加完成。

B.盖上盖子，在40℃杂交25分钟。

C.将空玻片架放入盛有200ml 1X洗液的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从孵育器取出，甩掉反应液1，将玻片放入玻片架(注意各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm)。换新的1X洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

9.反应2

请确认反应2已在40℃恒温箱中预热至少6分钟左右，并上下颠倒混匀至肉眼观察无沉淀

A.逐一将玻片取出，甩掉正面残存的洗液，背面用吸水纸擦干，将玻片放在孵育器面板上后立即在疏水圈范围内滴入6-8滴(约150-200ul)预热的反应液2覆盖整片组织。然后接着处理下一张玻片直至全部滴加完成。

B.盖上盖子，在40℃杂交15分钟。

C.将空玻片架放入盛有200ml 1x洗液的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从孵育器取出，甩掉反应液2，将玻片放入玻片架(注意各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2  分钟(200rpm)。换新的1x洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

10.反应3

请确认反应3 已在40℃恒温箱中预热至少6分钟左右，并上下颠倒混匀至肉眼观察无沉淀

A.逐一将玻片取出，甩掉正面残存的洗液，背面用吸水纸擦干，将玻片放在孵育器面板上后立即在疏水圈范围内滴入6-8滴(约150-200ul)预热的反应液3覆盖整片组织。然后接着处理下一张玻片直至全部滴加完成。

B.盖上盖子，在40℃杂交15分钟。

C.将空玻片架放入盛有200ml 1X洗液的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从孵育器取出，甩掉反应液3，将玻片放入玻片架(注意各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm)。换新的1x洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

11.反应4

请确认反应4已经回复室温。

A.逐一将玻片取出，甩掉正面残存的洗液，背面用吸水纸擦干，将玻片放在湿盒内，立即在疏水圈范围内滴入2-4滴(约80-160ul)反应液4覆盖整片组织。然后接着处理下一张玻片直至全部滴加完成。

B.避光室温反应5-10分钟(此时间可调整以增强或减弱信号)。请确保每一张片子的反应时间保持一致，以保证结果的可比性。

C.将空玻片架放入盛有200ml 1x洗液的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从湿盒取出，甩掉反应液4，将玻片放入玻片架(注意-各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm).换新的1X洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

12.反应5

请确认反应5 已经回复室温。

A.逐一将玻片取出，甩掉正面残存的洗液，背面用吸水纸擦干，将玻片放在湿盒内，立即在疏水圈范围内滴入2-4滴(约80-160ul)反应液5覆盖整片组织。然后接着处理下一张玻片直至全部滴加完成。

B.避光室温反应15分钟。

C.将空玻片架放入盛有200ml 1X洗液的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从湿盒取出，甩掉反应液5，将玻片放入玻片架(注意各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm)。换新的1X洗液，共进行两次各两分钟的洗涤。

13.显色反应

请确认底物稀释液已经回复室温。

A.新鲜配制底物:在试管中加入1mL常温的底物稀释液(足够6张玻片)，加入16微升底物1,混匀,再加入16微升底物2，混匀，该底物必须在10分钟内使用。

B.尽量甩掉玻片上的残留洗液，在疏水圈内加入100-150uL新鲜配制的底物。常温在湿盒内避光孵育5分钟。

C.将空玻片架放入盛有200ml 纯水的洗片缸中。

D.逐一按顺序将玻片从湿盒取出，甩掉底物，将玻片放入玻片架(注意各片间隔时间以保证杂交时间一致)。

E.手提玻片架上下持续洗涤玻片90-120秒。或者使用水平震荡仪震荡洗涤2分钟(200rpm)。换新的纯水，共进行两次各两分钟的洗涤。

14. 核染并封片

A.将玻片转移到含有200ml苏木精的染缸中染色5-30秒(依所使用的苏木精浓度而定)。或者在玻片上疏水圈范围内加400微升苏木精染色液。

B.用新的200ml纯水洗一分钟，重复三次，去除多余苏木精。

C.在200ml 0.02%的氨水中浸泡5秒钟。

D.用新的200ml纯水洗一分钟，共两次。

E.如果打算使用荧光显微镜查看实验结果，可以将玻片浸泡在200毫升DAPI 染色溶液中1分钟，而后用200毫升新鲜ddH20冲洗1分钟。

F.从玻片架中取出玻片，然后轻轻地甩掉表面多余的液体,用吸水纸擦拭玻片背面。将玻片放在空气中风干，确保在封装前完全干燥(约20分钟)。

G.用推荐的封片剂(水性或非水性封片剂均可)和盖玻片直接封片。也可使用酒精脱水，二甲苯浸泡后封片。

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